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什麼影響管柱效能? Column Efficiency

3/18/2014

層析專欄

層析的主要目的就是分離，為將目標分析物從樣品中分離分析（或是純化）。接下來幾篇文章我們簡單的來探討層析中的各項參數如何影響分離的效果。

管柱效能Column Efficiency

很多人討論到管柱的柱效(Efficiency)或是效能(performance)，大多會談到理論板數，而理論板數(N)的計算可以請大家參考以下公式一，理論板數受到峰的保留時間(tR)以及峰寬(Peak Width)所影響，當保留時間愈長以及峰寬愈小時，理論板數就愈大；反之當保留時間愈短且峰愈寬時，理論板數會下降。

《公式一》

那麼為什麼我們那麼在意理論板數的大小呢? 主要的原因是理論板數影響著峰與峰的分離狀況(解析度Resolution, Rs)，如公式二所示，理論板數愈高，兩支峰的分離狀況愈好(解析度愈高)；反之理論板數若太低，兩支相近的峰則可能會連在一起無法分離，下圖一為管柱效能對峰分析效果的影響範例。

《公式二》

《圖一》

我們剛剛提到理論板數受到兩個因素的影響，第一個是”峰的保留時間(tR)”，因此在不調整移動相等參數的情況下，如何讓峰的保留時間延長呢? 最簡單的方式是使管柱變長，例如將150mm管柱改成250mm管柱，可以增加峰與峰間的分離度，但是缺點是分析時間會變長且管柱壓力也會變高。

如果不想延長分析時間但仍想提升解析度該怎麼辦? 這時候第二個參數”峰寬”就派上用場了，那什麼會影響我們的峰寬呢? 范第姆特方程式(Van Deemeter)解釋了峰寬的形成因素，峰寬受到填料顆粒大小以及擴散等效應的影響。管柱內的填料顆粒大小(Particle Size)以及顆粒的一致性會影響峰寬的大小，如下圖二，大家可以清楚的瞭解填料顆粒對峰寬的影響。當顆粒愈小時，峰會愈窄；反之，顆粒愈大時，峰會愈寬。但相對的當顆粒愈小時，管柱的壓力會愈高，顆粒通常小於2μm的管柱往往會高過400bar一般HPLC儀器的操作壓力，因此後來當科技技術進步，UHPLC也就因運產生，搭配顆粒通常小於2μm的短管柱使用，取得極高的管柱效能。

《圖二》

小顆粒管柱雖然帶來極高的管柱效能，但是卻不能應用在一般的HPLC儀器上，而一台UHPLC動輒數百萬元，不是人人可以負荷的。因此後來核-殼顆粒技術（Core-Shell technology)的出現，提供了折衷的解決方案，使得一般HPLC儀器有機會實現更高的管柱效能。核-殼顆粒使用實心的核加上外層包覆的多孔隙矽膠層，減少傳質效應（Mass Transfer)的影響，提升管柱的效能，此外使用大於2μm的填料顆粒，降低管柱產生的背壓，可以在一般的HPLC儀器上操作並獲得更好的圖譜解析度。

那麼除了管柱理論板數之外，還有什麼影響圖譜的解析度呢？接下來的文章會再介紹其他影響解析度的參數。我們下次再見！

關鍵字：液相層析、解析度、理論板數、核-殼技術

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環境半揮發性物質分析

7/31/2013

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同義關鍵詞: EPA Method 8270D、Semi-VOA、BNA、EPA 525、EPA 625、SVOA

這是最常見的環境分析之一，涵蓋分析廣泛不同的半揮發性物質的方法，其中如鹼、酸、中性物質、殺蟲劑、鄰苯二甲酸鹽等等。分析物質列表列出最少80種化合物質，而當加上附錄化合物則可達數百種物質，由於分析物質十分複雜有共同流出的可能，因此分析必須以GC-MS來進行，質譜儀為分析辨識不同分析物共同流出物質所必備的條件。

樣品的前處理通常依據不同的混合物性質以液─液萃取(Liquid-Liquid Extraction, LLE)、自動溶劑萃取(Automated Solvent Extraction,ASE)、或是固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)進行萃取。由於萃取不具非常的選擇性以及萃取後可能仍有許多汙染物質在樣品中，汙染物可能會累積在系統、注入口、管線與管柱中，因此內襯墊片可能必須經常更換而管柱壽命也通常比較短。

在進行任何樣品的分析前，系統必須要先進行適合的混合物分析，此混合物依據方法來選擇適合的分析物，如五氯酚(酸)、對二氨基聯苯(鹼)、與DDT(殺蟲劑)以及DFTPP(通常作為檢測質譜儀效率的標準品)。這些混合物的分析必須要有足夠的反應結果，否則系統必須進行保養檢查來改善分析效果。

此方法使用六種含重氫的多環芳香烴(PAH)化合物作為內標準品，而樣品萃取、清潔、或是濃縮後的檢量線範圍大約為1至500 ppm，而中等濃度的檢量樣品也應定期進行"持續校正檢察(Continuing Calibration Check, CCC)"來確認系統的穩定性，若是CCC結果反應降低超過15%，則必須重新測定檢量線。

由於有質譜儀的出現，任何層析分析的共同流出物質可以藉由質譜儀作分離。只有當分析物具有相似的質量時必須先以層析方法做分離，否則相似質量的分析物將會被當作同樣的物質形成單一的波峰訊號進行定量，Benzo[b]fluoranthene與Benzo[k]fluoranthene同分異構物即為其中一個特殊的問題案例；5% phenyl的管柱最適合作為Benzo[b]fluoranthene與Benzo[k]fluoranthene的分離，而流速與分析溫度也是決定其分離的因素，任何建議環境條件的變動都可能犧牲分析的靈敏性。

以下是一些常見的建議應用，包括色譜條件以及樣品分析物的辨識，大內徑的管柱提供較高的檢量範圍而小內徑的管柱提供較快速的分離以及較低濃度的偵測效果，而20x0.18x0.32尺寸的管柱為兼具快速分析與較大樣品分析量的優良選擇。

一般的建議尺寸
ZB-5ms 30x0.25x0.25 – Application ID 14953
ZB-5MSi 30x0.25x0.25 – Application ID 16413
ZB-SemiVolatiles 30x0.25x0.25--NEW!!!

快速GC管柱的建議尺寸
ZB-5ms 20x0.18x0.18 – Application ID 15695
ZB-5ms 20x0.18x0.32 – Application ID 15696

關鍵字: 半揮發性、8270、環境

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環境中揮發物質的分析

6/30/2013

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同義關鍵詞: EPA Method 8260B, EPA Method 524.2, EPA Method 624, Volatiles

本篇文章中介紹揮發性物質的篩選方法，環境中揮發性物質常見為沸點低於200℃的溶劑或是揮發物，且通常具有毒性。而大量物質的氣相層析(通常大於80種)常常會導致多種化合物同時流出(co-elution)，因此使用質譜分析常常必需經過核查並且進行定量。

吹氣捕捉樣品的製備方式常被用作低層級的偵測範圍樣品濃縮的用途，接著樣品注入氣相層析管柱ZB-624，其固定相專為EPA方法624所設計，管柱與偵測器皆用於定量分析，因此要求共同流出的分析物必須具有不同的質量。

在分析進行之前，先進行系統效能檢測混合物(System Performance Check Compounds, SPCC)的注入以確認系統的效能，此混合物的內容包括：氯甲烷(chloromethane); 1,1-二氯乙烷(1,1-dichloroethane); 三溴甲烷(bromoform); 氯苯(chlorobenzene);與1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-tetrachloroethane)。目的為測試系統活性與吹氣捕捉能力，以及符合各種樣品所需的最小反應因子。

一旦系統通過測試，可以使用內標準品法製作至少五點的檢量線作為定量分析使用。相對標準偏差值(Relative Standard Deviation,RSD)可以經由各化合物分析反應因子結果計算得到，其RSD值必須低於15%；此外，檢量檢測物質(Calibration Check Compounds, CCC。其中包括較差效能的物質: 1,1-二氯乙烯(1,1-Dichloroethene), 甲苯(Toluene), 氯仿(Chloroform), 乙苯(Ethylbenzene),1,2-二氯丙烷(1,2¬Dichloropropane), 氯乙烯(Vinyl chloride))，其RSD值必須低於30%。.

12個小時後，系統的效能必須再以系統效能檢測混合物(SPCC)再次檢測以確認系統的不同批次分析能力的效能值，此外再次分析中間濃度的檢量檢測混合物(CCC)，而無反應因子可能會關閉超過20%。

使用吹氣捉捕的樣品收集方法可以降低高分子量汙染物可能注入管柱的影響，因此管柱的壽命可以更長；然而這個方法仍然有些問題存在和一些常見的歸納如下：

某些分析物無法作良好的吹氣捕捉 ─ 吹氣捕捉樣品收集的方法對於揮發性物質可以達到良好的工作效率；但對於非揮發性物質則有較差的結果。
若是分析環境條件設計不當可能會導致樣品過度吸附(carryover) ─ 每次分析間可能需要更多的環境流洗時間，來移除或是降低樣品過度吸附殘留的問題。
不可逆的吸附捕捉 ─ 某些化合物經過吸附捕捉後就無法再釋放出來進行分析，這可能會導致吸附捕捉器趨於飽和並改變其實際的極性性質。
吸附捕捉步驟可能會成為方法的限制步驟(Limiting Step，約20分鐘) ─ 即使是快速的氣相層析分析也可能要花時間在樣品製備(捕捉萃取)的等待時間，某些實驗室會使用兩組吹氣捕捉的設備來進行試驗，但這樣太過昂貴且不普及。
吹氣流速難以優化 ─ 吹氣流速若是太低，三溴甲烷(Bromoform)將會流失；而吹氣流速若是過快，氯甲烷將會流失。

建議應用：
App 14783 – EPA Method 8260B on ZB-624 – 60 m x 0.25 mm x 1.4 µm
App 15866 – EPA Method 8260B on ZB-624 – 20 m x 0.18 mm x 1.0 µm

關鍵字: 揮發性、溶劑、EPA8260

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基準線的波動 ─ Baseline Oscillations

4/30/2013

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基準線的波動可能會造成背景值的增加並影響方法定量，基準線的波動有時候被認為是一種干擾值(但是比一般干擾值變動來得緩慢)，檢視波動時的頻率以及層析溫度的變化有助於釐清干擾的原因。

緩慢的波動 ─ 基準線波動頻率與溫度的梯度無關。引起這現象的原因可能是氣體壓力的波動所造成；空氣壓縮機的儲存罐可以增加線性壓力令層析流速提高使得訊號提升，而儲存罐壓力降低會造成壓力以及流速的降低而造成基準線的波動，使用雙階段的壓力調節器有助於減少由壓力波動引起的問題。

快速的波動 ─ 基準線波動的平均間隔以及頻率與溫度梯度無關。引起這現象的原因可能由於偵測器的問題；加熱偵測器到最高溫度(450℃ for FID)30分鐘到1小時可能可以短暫的減緩這個現象，在分析完畢後，建議對偵測器進行根本上的清潔。

溫度相關的波動 ─ 基準線波動的頻率與溫度相關，快速的溫度梯度攀升導致高頻率的波動出現直到達到等溫梯度(層析圖譜的中央)；引起問題的原因可能是由於樣品或是注入口汙染(如矽氧烷siloxanes或是碳氫化合物hydrocarbons)，導致汙染物引入管柱內並分離形成波峰。更換樣品、清洗溶劑、線路、鍍金墊片或是注射針有助於消除汙染物的干擾問題。

Key words: Noise, baseline, contamination
Author: Kory Kelly
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溫度如何影響化合物的滯留時間？

4/9/2013

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蒸發(Evaporation)是指液體緩慢的由凝結態(液態)轉變為揮發態(氣態)的過程；凝結(Condensation)相對是指揮發態凝結形成液體的過程。這兩個過程會依據溫度變化而形成動態平衡，當溫度增加時，更多的物質會轉變為揮發態，反之亦然。

當分析樣品揮發時，其形成的揮發氣體將會推擠已存在的氣體形成蒸氣壓(vapor pressure)；當溫度上升時，揮發的速率會上升並導致蒸氣壓的形成，溫度(以及蒸氣壓)可以持續上升直到與上述的液體壓力達到平衡，這個溫度即為物質的沸點，而此時物質將會由整個樣品開始揮發而不是僅僅只有表面開始。

不同的物質具有不同的蒸氣壓速率以及沸點溫度，正是這些差異使得不同的物質可以在氣相層析管柱中進行分離。

若烘箱溫度過低，分析物將會花更多的時間在穩定相中凝結，而只有少量的分析物可以揮發，由於液體轉變為氣體的過程太過於緩慢使得分析物的滯留時間過長；相對的，假設溫度太高，會使得氣液平衡偏向氣相，分析物在管柱中幾乎不會凝結進入穩定相(或是交互作用)，會導致滯留時間太短。

氣相層析最好的運作環境是分析樣品可以在穩定相與氣相中達到動態平衡，理想的分離效果應該必須取得適當的溫度使得分析物可以穩定的進出穩定相，一般溫度設在分析物沸點下20-50℃之間。

等溫(isothermal)分離可以以這樣的溫度設定範圍來取得最佳的分離效果；若是要使用溫度程序梯度來取得問題分析物的最佳分離條件，建議梯度變化設定應當緩慢而不劇烈。

Key words: GC, temperature, retention time
Author: Kory Kelly
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快速氣相層析是如何運作的?

4/4/2013

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快速氣相層析使用較小的內徑管柱來幫助減少氣相層析的分析時間，原因是由於小內徑的管柱可以提升分析的效能，因此可以使用較短的管柱來縮短分析的時間。較小的管柱內徑可以藉由增加傳質作用來獲得較佳的效能，因此可以減少管柱的長度來獲得寬內徑長管柱相同的效能，如30 x 0.25 x 0.25管柱與20 x 0.18 x 0.18有相似的效能，而0.18 mm內徑的管柱只有20公尺長。

下表為不同內徑的管柱效能比較可提供參考，以0.25 mm內徑管柱為基準下，0.18 mm內徑的管柱可以提升39%的效能，因此我們減少33%的管柱長度(15公尺改為10公尺)後仍可以維持效能與解析度。

使用短管柱是縮短分析時間的關鍵，事實上使用30 x 0.18 x 0.18管柱分析的樣品滯留時間比30 x 0.25 x 0.25管柱還要長，原因是由於較小內徑管柱分析氣體攜帶樣品分子與管柱內徑向交互作用的次數高於寬管柱，因此樣品滯留時間會比較長，因此僅僅縮小管柱內徑並無法縮短分析的時間。假若您原先使用15 x 0.25 x 0.25的管柱，我們建議您可以使用10 x 0.18 x 0.18的管柱來縮短您分析的時間。

當使用較小內徑的管柱時，請注意靜相的膜厚度也會隨著內徑降低，這是為了維持相比率(Phase Ratio, ß)的相同性(會影響管柱的選擇性)，此外降低膜厚度也會降低管柱的容積。因此高分流比率的方式可以利用(最常使用的方式)或是選用較厚的膜厚度管柱。高分流將會降低樣品分析樣品於管柱內的量以及些微的偏移，並縮短在管柱內與靜相交互作用的時間，因而產生較窄的與較高的波峰形。

若是使用較厚的膜厚度管柱，將會影響相比率並可能造成選擇性與樣品流出次序的改變，這可能會對分析化合物產生額外的滯留性影響而可能改變某些使用短管柱的優點，另外使用較厚的膜厚度管柱也將降低管柱的效能性，這是由於膜厚度會影響樣品分子於管柱內靜相的擴散程度並減緩傳質作用(影響較小而微不足道)。

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固相萃取(SPE)的樣品前處理建議

2/28/2013

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環境樣品

土壤, 汙泥樣品

將樣品加入有機溶劑或水溶液進行均質化(Homogenization)，添加的溶劑取決於分析物的溶解度，之後過濾並除去懸浮物；以索氏萃取法(Soxhlet extraction)進行萃取。

膏狀, 糊狀樣品

油性物質(Oil based): 將樣品溶解於非極性溶劑 (hexane) ，並以極性固相萃取方法(polar SPE)進行萃取。

水性物質(Water based): 將樣品溶於水或是水混有機溶劑(甲醇)中，並以非極性固相萃取方法(non-polar SPE)進行萃取。

水果, 蔬菜, 藥草樣品

將樣品加入有機溶劑或水溶液進行均質化(Homogenization)，添加的溶劑取決於分析物的溶解度，之後過濾並除去懸浮物。選用適當的溶劑以及固相萃取方法 (己烷 = 極性固相萃取方法; 水溶液 = 非極性固相萃取方法; 甲醇/乙腈=非極性固相萃取方法或是極性固相萃取方法)。

生物性樣品 (液體)

尿液, 全血, 血清, 體液, 膽汁等樣品

以適當的緩衝液1:1稀釋樣品，蛋白質沉降 (硫酸鋅、乙腈)、尿液葡萄胺酸水解、蛋白質鍵結裂解 (超音波震盪法, 酵素裂解法, 酸/鹼裂解法)。

生物性樣品 (固體)

器官組織, 糞便, 消化道內容物等樣品

將樣品加入有機溶劑或水溶液進行均質化(Homogenization)，添加的溶劑取決於分析物的溶解度，之後離心或過濾除去懸浮物。直接以基質固相分散技術 (Matrix Solid Phase Dispersion, MSPD) 對組織進行萃取。

關鍵字: 固相萃取

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檢量線(Calibration Curve)的建立

9/19/2011

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檢量線的製作幫助您HPLC的定量分析，但是定量前我們必須要先了解偵測儀器的對於分析物的最低偵測極限(LOD，表示您的偵測器最低濃度極限)以及最大偵測極限(表示高於此濃度您的偵測器已經偏離正確濃度值)，然後選擇合適您的濃度範圍製作檢量線。因此在還沒有任何關於您的儀器以及分析物偵測極限的資訊前，可能需要先進行一些試驗來獲得這些資訊。

首先您必須先確定您的HPLC分析方法以及移動相是否能有效分離您的混合物樣品。接著針對欲分析物的標準品(假設已知標準品最高濃度為1 mg/ml = 1000 ppm)，依序列稀釋製備標準品溶液高、中、低三種濃度(如1000 ppm, 500 ppm, 50 ppm等)1，以您的HPLC層析方法進行分析(建議至少三重複試驗)。

由您的層析圖譜判讀，假設最高濃度1000 ppm超出偵測器的偵測範圍，請稀釋濃度(如900 ppm甚至更低)到儀器的可以分析的範圍；假設低濃度50 ppm還可以偵測出來，請試著稀釋更低的濃度(如25 ppm, 10 ppm, 甚至1 ppm-0.1 ppm，若是10 ppm可以分析圖譜可以偵測得到，而1 ppm卻無法偵測，此時我們認為您的針測最低極限為10 ppm，也有可能更低如9 ppm, 8ppm等)。在獲知儀器的偵測範圍後，我們可以選擇合適的濃度範圍進行檢量線的製作(在這裡我們假設以100-900 ppm作檢量線)。

外標準品法 ─
我們稀釋標準品濃度為900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 ppm九種濃度(可依據您的需要選擇採樣點，但建議至少需求五點以上)，接著進行HPLC分析以濃度對積分面積作圖，假設得到以下結果：

藍色點是理想的檢量線(呈現性，並漂亮的通過原點)，這使我們可以以100-900 ppm作為檢量線的適合濃度範圍，並計算得知此定量方程式；而紅色點表示儀器偵測在800 ppm以上與200 ppm以下的偵測濃度已經開始偏移(200 ppm以下分析物濃度由儀器偵測已經不準確)，建議您使用200-800 ppm(甚至300-700 ppm)以內的範圍取樣點製作檢量線與計算定量方程式。

內標準品法 ─
內標準品法類似外標準品法，只是在我們配置標準品濃度時同時加入了另一種已知物質標準品(此標準品必須自身穩定，不與分析物混合樣品發生反應、不干擾試驗分析物的滯留時間並且可以被相同的HPLC分析方法所偵測到)。

我們同樣配置標準品濃度為900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 ppm九種濃度(每種濃度裡頭都內含等量的標準品如100 ppm)，接著進行HPLC分析並已以濃度對積分面積比(分析物標準品積分面積/內標準品積分面積2)作圖，並依據作圖結果製作合適的檢量線定量方程式。

註1. 一開始可以就設定多些的濃度取樣點，不僅限於三中濃度，以免需要重覆重新配置。
註2. 作圖方法：假設900 ppm分析物標準品積分面積為90000，100 ppm內標準品積分面積為5000，因此得到分析物標準品積分面積/內標準品積分面積為18；同理，800 ppm分析物標準品積分面積為80000，100 ppm內標準品積分面積為5000，得到分析物標準品積分面積/內標準品積分面積為16，我們就依據濃度對此積分面積比製作檢量線方程式。
註 3. 分析物如果於HPLC分析太濃，請稀釋至適合濃度作分析。

關鍵字：HPLC, 偵測極限, 檢量線
Author: Cheng-Chieh Hsu
新丹企業有限公司SCIENIFIC HIGHTEK CO., LTD.
TEL: (02)2652-2200 FAX: (02)2653-0022 E-Mail: [email protected]

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什麼影響管柱效能? Column Efficiency

環境半揮發性物質分析

環境中揮發物質的分析

基準線的波動 ─ Baseline Oscillations

溫度如何影響化合物的滯留時間？

快速氣相層析是如何運作的?

固相萃取(SPE)的樣品前處理建議

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